分子实验介绍——荧光定量PCR检测
荧光定量PCR是检测生物样品中RNA含量的普遍的方法,通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对产物进行分析,计算待测样品模板的初始浓度。目前主要使用Sybr green和taqman法对RNA含量进行检测。Sybr green在低样本量时成本较低,目前选用的较多。从单个的生物体到qi官到组织到细胞,再从细胞结构到核酸和蛋白的分子水平,人们意识到可以通过检测分子水平的线性结构(如核酸序列),来横向比较不同物种,同物种不同个体,同个体不同细胞或不同生理(病理)状态的差异。
SYBR Green I是一种只与DNA双链结合的荧光染料。当它与DNA双链结合时,发出荧光;从DNA双链上释放出来时,荧光信号急剧减弱。因此,在一个体系内,其信号强度代表了双链DNA分子的数量。SYBR Green荧光染料法定量PCR的基本过程是:1、开始反应,当SYBR Green染料与DNA双链结合时发出荧光。2、DNA变性时,SYBR Green染料释放出来,荧光急剧减少。3、在聚合延伸过程中,引物退火并形成PCR产物。4、聚合完成后,SYBR Green染料与双链产物结合,定量PCR系统检测到荧光的净增量加大。转录组测序转录组即某个物种或特定细胞在某一功能状态下产生的RNA的总和,是研究细胞表型和功能的一个重要手段。
实验流程:细胞或组织RNA提取-RNA浓度检测-RNA逆转录-定量PCR检测。
结果示例:
图 A 基因扩增曲线图;B 基因扩增溶解曲线图;C mRNA相对表达量变化
从图中可以扩增曲线可以看出目的RNA扩增效果,溶解曲线可以看出引物识别特异性情况,通过使用ΔΔCt方法计算可以得到每个组中目的mRNA表达变化。
腺病毒包装原理介绍
腺病毒是一种没有包膜的直径为79-90nm的颗粒,由252个 壳粒呈二十面体排列构成。每个壳粒的直径为7-9nm。衣壳里是线状双链DNA分子,两端各有长约100bp的反向重复序列。高l效液相色谱(High-performanceLiquidChromatography,HPLC)HPLC是--种比较传统的方法,是根据DNA或蛋白分子量和构象的不同而使其加以分离。人体腺病毒 已知有33种,分别命名为ad1-ad33,研究详细得是ad2.
腺病毒是一种无包膜的球型结构的病毒,遗传物质为线型 双股DNA形式。腺病毒的特点:(1)gan染范围广对人致病性低;(2)对增殖和非增殖细胞均具有gan染性;(3)能有效进行增殖;( 4)病毒滴度高;随后设计BSP引物进行PCR,在扩增过程中尿嘧定全部转化为胸腺嘧定,zui后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生jia基化,称为BSP-直接测序法。(5)不整合到染色体中,无插入致突变性;(6)外源基因装载容量大。由于腺病毒的这些特点使其广泛地应用于体 外基因转导、体内接种yi苗、和基因zhi疗等各个领域。
实验方法
1.获得目的基因序列;
2.构建病毒表达载体质粒;
3.表达载体质粒和包装质粒重组;
4.gan染HEK293,包装出病毒;
5.病毒扩增、浓缩;
6.滴度测定。
RNA提取预备工作RNA酶(Rnase)是导致RNA降解主要的物质。此酶非常稳定,在一些的条件下只可暂时失活,但限制因素去除后又迅速恢复活性。常规高温高压灭菌方法和蛋白抑制ji不能使所有的Rnase完全失活。
1.它广泛存在于人的皮肤上,因此制备RNA时必须戴手套
2.RNase的又一污染源是取液器。根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。一般情况下采用以DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部,可基本达到要求。
3. 塑料制品、玻璃和金属物品的处理
(1)塑料制品:尽量使用一次性无菌塑料制品。已标明RNase-free的塑料制品,如没有开封使用过,通常不必再处理。
注意事项
1. 为了避免蛋白质变性,不要对样品剧烈搅动和反复冻融。
2. 缓冲溶液成分尽量模拟细胞内环。。
3. 为了避免蛋白质的氧化,将 0.1~1 mmol/LDTT(二硫苏糖醇)(或 β-巯)加入到缓冲溶液中。
4. 为了避免重金属对目标蛋白的破坏,将 1~10 mmol/LEDTA 金属螯合剂加入。
5. 为了避免微生物生长,使用灭菌溶液。在纯化任何一种蛋白质的时候,均必须时刻对它的稳定性注意维护,使它的活性得到保护,需要牢记如下一些通用的注意事项。
6. 尽可能置于冰上或者在冷库内进行操作。
7. 蛋白浓度不要太稀。
8. 除非是进行聚焦层。否则 pH 需要合适,防止所使用的缓冲溶液 pH 与 pI 相同,使蛋白质的沉淀得以避免。
9. 使用蛋白酶,避免蛋白酶对目标蛋白的降解;在纯化细胞中的蛋白质时,将 DNA 酶加入来使得 DNA 降解,避免 DNA 对蛋白的污染。