脑组织组化实验
1. 灌注固定用的针头，一般都用注she针头。灌注大鼠一般可用 10 到 12 号针头，小鼠可用 6、7 号针头，但很重要的一点是要把针头的磨钝而不是用锐利的针头。
2. 关于穿刺：灌注大鼠时要把穿刺针的插入到升主动脉内，但不宜进入升主动脉过长，在动脉内见到针头或插入约 1mm 左右即可；灌注小鼠时只要把针头插入左心室内即可，不必要插入到升主动脉内。操作的要点是：，操作要迅速，剪开膈肌后，迅速沿腋前线剪开胸壁，并把胸前壁往上翻，暴露心脏；第二，一定要在明视野下操作，要剪开心包壁层的前壁，暴露升主动脉和肺动脉干的根部，确保穿剌针能进入升主动脉；第三，穿刺之前要用适当大小的血管钳夹住心室以固定心脏，但不要夹得过紧，要让心腔内留有一定的间隙，然后在心尖处轻轻旋转针头插入穿刺针。也可以用小剪刀在心尖处先剪开一个小口再插入穿刺针；第四，穿刺方向要正确，从心尖部开始，从左下方斜向右上方，若遇阻力要改变方向再试，不要用力蛮插。
3. 灌注用生理盐水的量大鼠用 50ml 左右，小鼠用 10ml 左右，一般以从右心耳流出的液体清亮为标准；4% 多聚甲醛用量约相当于老鼠体重，如 300 克的老鼠用 300ml 左右。小鼠一般用 20-30ml。灌注速度先快后慢，可持续 1-2 个钟头，也可以稍快。取脑后置脑块于 4% 多聚甲醛内 4 度后固定 4-6 个钟头。
2.2旋转圆筒睡眠剥夺法
此方法于 1979 年先应用于睡眠剥夺实验中，设备主要由一柱形圆筒及一小型慢速马达构成。圆筒直径 30 cm，高 30 cm 。圆筒底由 PVC (聚)构成，侧壁由直径为 10.4 m m 的 PVC 杆围成。杆长度 30 cm，杆之间间隔 15.5 m m，圆筒与小型马达相连。马达转速为每 45 s转 1 圈(也有学者应用每 m in 转 1 圈)。至少在实验前 2 d每天将大鼠放入圆筒中适应环境 1 次，适应时间不少于 3 h。实验时将马达按 45 s每1 圈进行匀速转动，通过圆筒的转动带动大鼠不停运动而达到睡眠剥夺的目的。此类方法简单易行，睡眠剥夺效果明显。缺点是长时间不停运动可引起机体的运动后应激反应及身体疲劳，可能干扰睡眠剥夺实验结果! 此类方法发展出多种变化，有实验者在进行新生大鼠睡眠剥夺时将筒旋转速调节至 2~3 r/m in后期逐渐增加至 6~7 r/m in。
敲低效果验证方法：
RT-PCR
检测mRNA，是否仍存在靶 mRNA？或是否敲低成功？
这种方法非常灵敏，但无法准确预测蛋白质水平。
蛋白质印迹实验
使用抗ti来检测样品中的靶蛋白表达以及多种相关蛋白质表达，从而观察靶蛋白敲除对其它蛋白质的影响。
免yi细胞化学法
可检测是否存在敲低蛋白。
其优势在于利用双重染色法，可同时检查敲除对其它蛋白质表达的影响以及其它蛋白质在细胞中的位置。
ROS也就是活性氧（reactive oxygen species，ROS）指来源于氧的自由基和非自由基。ROS在细胞生命，应激和si亡中具介导作用，并且不同浓度的ROS在其中起着截然不同的作用，从而导致细胞命运的不同。因此对ROS的浓度或相对水平进行可靠的测量非常有必要。
实验仪器和材料
细胞培养基
胎牛xue清
青mei素/链mei素
胰酶
PBS
DMSO
活性氧（ROS）试剂盒
血球计数板
CO2培养箱
倒置荧光显微镜
实验步骤1、细胞传代培养：当细胞长至80-90%时，去除培养基，加入PBS洗1-2次，去除PBS后，加入1ml胰酶消化1-3min后，加入3ml完全培养基中和胰酶终止消化，将消化的细胞转移至15ml离心管中，1000rpm离心5min。倒掉上清后，加入3ml培养基重悬细胞，1:3传代至培养皿中培养。
2、将长到培养皿80%-90%的内皮细胞用胰酶消化下来，1000rpm离心，去除上清，加入完全培养基重悬细胞，将细胞分别种在6孔板中，每孔种1×106个细胞。3、待细胞贴壁后，使用不同的含药xue清的培养基培养细胞。3、待细胞贴壁后，使用不同的含药xue清的培养基培养细胞。4、48h后，加入DCFH-DA于培养基中，稀释倍数为1:1000。5、孵育1h后，直接将细胞置于荧光显微镜下拍照。
实验结果
