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乐山单细胞测序技术货真价实 英瀚斯生物科技公司苏完瓜尔佳 敏敏
2023-11-30 01:10  浏览:48
7分钟前 乐山单细胞测序技术货真价实 英瀚斯生物科技公司[英瀚斯2eefa30]内容:

成纤维细胞分离方法

1.处死孕鼠,全身置于75%酒精里浸泡,然后在超净台中用剪刀和镊子将孕鼠皮肤剪开,用另外- -组剪刀、镊子剪开腹部肌层,露出,后用第三组剪刀和镊子将小心取出放在盛有D-PBS的玻璃平皿中,冲洗去血。

2.用两把弯镊子将胚胎外的胞膜小心去除,然后夹掉头和内脏,将其余胚胎转移到一个装有30 ml D-PBS的50 ml离心管中,轻轻颠倒两次,倒掉D-PBS,再重复此步骤一次,注意要留少许D-PBS,然后将胚胎转移到另- -装有D-PBS的平皿中,并用手术刀片将其细细切碎。软gu细胞培养(1)豚鼠脱颈处死,备皮,用75%酒精消毒背部及四肢皮肤。

3. 用200 μ的移液反复、快速地吹打平皿中的液体,转移至15 ml离心管中,于4C 1500 rpm离心5分钟,倒掉上清,以10 ml胰酶重悬沉淀,放在37C水浴中消化30分钟,且每隔五分钟轻轻晃动,使之充分消化。

4.将上层细胞悬液倒入一个装有10 ml MEF生长培养基的50 ml离心管中,用200目的尼龙网过滤后,以1500 rpm离心5分钟收集细胞,再用30 ml MEF生长培养基洗涤两次。

5.细胞沉淀用15 ml MEF生长培养基重悬后进行细胞计数(- -般8只14天的胎鼠可获得2-3x107细胞)。

6. 3x106细胞悬浮于15 ml MEF生长培养基中,接种到200 ml培养瓶中。

7. 24小时后更换新鲜的MEF生长培养基。

8.细胞长满后,先用D-PBS冲洗,倒掉后加胰酶消化(此步时间不宜过长,作者- -般不超过五分钟),按1:5传代。

9. 细胞再次长到覆盖率80-90%左右, 将其消化后,常规冻存(冻存液要现配)。

细胞培养中常见的污染及解决方法

霉菌污染

正常情况下,培养基在 37℃ 培养箱中培养两三天,在倒置显微镜下仍保持透明,无杂质。一旦出现絮状杂质,显微镜下可见丝状和团块状漂浮物,菌丝明显。此时,虽然细胞仍在生长,但它们的生命状态会在长时间后逐渐恶化。

解决方法:用硫酸铜溶液擦拭 CO2 培养箱,向托盘中加入饱和硫酸铜或消毒后加入饱和磷酸氢二钠高盐溶液,避免霉菌污染。

如果霉菌污染,暂时转移所有细胞,并立即使用 guo 氧擦拭培养箱,包括层板和内壁。细胞毒性越大,则颜色越浅,对于同样的细胞,颜色的深浅与活xi胞的数量成正比,因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。将 guo 氧放在培养箱中一小时,使蒸汽扩散,待 guo 氧气味消散后,将细胞转移到培养箱中。值得注意的是,培养箱需要每两个月定期清洗一次,尤其是在梅雨季节。用 84 消毒液、清水和 75% 酒精连续擦拭培养箱,用紫外线照射也是一种有效的方法。

为防止霉菌污染,需添加 3μg/ml 、抑制素、fang

线菌素 D 或青链。LeageneMDC染色液适用于培养细胞的自噬染色,可与EB合用双染。一旦被污染,就不可能恢复,即使使用上述,也没有什么区别。对于支原体污染的细胞培养,选择是丢弃污染的培养物,并用使用新鲜的无支原体的储存液,消毒环境。如果所有的细胞都被污染了,那可能是整个培养系统污染了。因此,必须对培养基和实验设备进行检查。如果只是个别污染,可能是操作问题,有必要注意实验操作步骤的规范。

Q:如何避免中沉淀物的出现?

A:首先要注意正确的解冻步骤,而且溶解过程中一定要每隔一段时间均匀而缓慢的摇动。我们已经发现在下列情况下沉淀物可能增加,使用中应该尽量避免:

(1)热灭活;

(2)在 37℃ 下培养;

(3)反复冻融;

(4)γ 射线照射;

(5)长期储存在 2-8℃;

(6)在室温下放置时间过长

Q:如何去除中的沉淀?

A:如想去除这些絮状沉淀物,可以将分装到无菌离心管中,以400g离心,上清液即可直接加入到培养基 内一起过滤。

注意:不要以过滤的方式去除这些絮状沉淀物,因为这可能阻塞滤膜。

2、快速脂质体转染法操作步骤如下 [方法二]:

(1) 以 5×105 细胞/孔接种 6 孔板 (或 35 mm 培养皿) 培养 24 小时,使其达到 50~60% 板底面积。

(2) 在试管中配制 DNA/脂质体复合物方法如下:

①在 1 mL 无 DMEM 中稀释 PSV2-neo 质粒 DNA 或供体 DNA。

②旋转 1 秒钟,再加入脂质体悬液,旋转。

③室温下放置 5~10 分钟,使 DNA 结合在脂质体上。

(3) 弃去细胞中的旧液,用 1 mL 无 DMEM 洗细胞一次后弃去,向每孔中直接加入 1 mL DNA/脂质体复合物,37℃ 培养 3~5 小时。

(4) 再于每孔中加入 20%FCS 的 DMEM,继续培养 14~24 小时,

(5) 吸出 DMEM/DNA/脂质体混合物加入新鲜 10%FCS 的 DMEM,2 mL/孔,再培养 24~48 小时。

(6) 用细胞刮或消化法收集细胞,以备分析鉴定。

3、稳定的脂质体转染方法如下:

(1) 接种细胞同前,细胞长至 50% 板底面积可用于转染。

(2)DNA/脂质体复合物制备转染细胞同前 (2)、(3) 步骤。

(3) 在每孔中加入 1 mL、20%FCS 的 DMEM,37℃ 培养 48 小时。

(4) 吸出 DMEM,用 G418 选择培养液稀释细胞,使细胞生长一定时间,筛选转染,方法参照细胞筛选法进行。

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